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文章插圖
來(lái)源：SCH通訊
一、研究目的：
甲基苯丙胺（methamphetamine ， MA）是苯乙胺類和安非他明類中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，常被作為消遣性藥物（毒品）使用。近年賴濫用MA的情況在青少年中越來(lái)越常見(jiàn) ，這已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
MA濫用除了會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)退行性變、增加腦血管意外風(fēng)險(xiǎn)之外，對(duì)生殖系統(tǒng)也有很強(qiáng)的毒性。它破壞下丘腦-垂體-睪丸軸的功能，降低促黃體生成素（luteinizing hormone ， LH）水平，破壞精子功能和睪丸結(jié)構(gòu) ，對(duì)男性生育能力產(chǎn)生負(fù)面影響。除此之外。對(duì)交配前、妊娠和哺乳期雌鼠進(jìn)行MA注射還會(huì)出現(xiàn)生理學(xué)和行為學(xué)方面的負(fù)面影響。此外在人類女性中還導(dǎo)致月經(jīng)周期的中斷和下丘腦-垂體-卵巢軸的功能障礙。
與其他成癮藥物相似，多項(xiàng)研究表明氧化應(yīng)激和線粒體損傷可能在MA誘導(dǎo)的遺傳毒性和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。這種細(xì)胞毒性和遺傳毒性可能加速生殖老化。然而， MA對(duì)年輕女性生育能力的潛在不利影響尚未被仔細(xì)研究。
人們普遍認(rèn)為卵巢濾泡衰竭是不可逆轉(zhuǎn)的。因此，評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備和卵泡衰竭的情況對(duì)女性生育期的長(zhǎng)短的評(píng)估具有重要意義 ?？姑缋展芗に兀ˋnti-Mullerian hormone ， AMH）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β ， TGF-β）家族的一員，由竇前卵泡和小的竇卵泡顆粒細(xì)胞產(chǎn)生。它對(duì)原始卵泡募集以及生長(zhǎng)卵泡對(duì)卵泡刺激素（follicle stimulating hormone ， FSH）的反應(yīng)有抑制作用，因此被認(rèn)為是卵巢儲(chǔ)備功能的理想標(biāo)記物。除了AMH ，卵巢卵泡計(jì)數(shù)也是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的一個(gè)重要指標(biāo) 。
盡管青少年接觸MA的情況越來(lái)越普遍，關(guān)于早期接觸MA對(duì)女性生育能力和卵巢儲(chǔ)備能力的長(zhǎng)期影響的研究卻很少。因此本研究的目的是探索有著長(zhǎng)期MA暴露史的青少年在成年后生育能力和卵巢儲(chǔ)備能力的情況。研究者提出假設(shè)：青少年女性的MA濫用會(huì)在成年后影響卵巢儲(chǔ)備功能和生殖能力。
二、研究方法：
建立一個(gè)女性青春期MA濫用的小鼠模型，從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生化、激素和行為學(xué)多個(gè)方面進(jìn)行評(píng)估（圖1）。
圖1
（1）女性青春期MA濫用小鼠模型的建立
將ICR雌性小鼠置于21±2℃、55±5%濕度、晝夜周期為12:12 h的環(huán)境中養(yǎng)育。用劑量5 mg/kg的MA或0.9%生理鹽水經(jīng)腹腔注射給藥（n = 24）。從出生后第21天開(kāi)始，每周連續(xù)3天，每天1次，連續(xù)8周。這種注射模式模擬了人類在周末消耗MA的模式。
（2）形態(tài)學(xué)研究：
① 用透射式電子顯微鏡對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，步驟如下：卵巢切片-固定-梯度脫水-修塊-超微切片-染色-觀察-拍照。
② 用光學(xué)顯微鏡對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察：采用傳統(tǒng)的機(jī)械方法從卵巢中分離顆粒細(xì)胞。細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度被被接種在6孔板中。在37℃ ， 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。光鏡下觀察顆粒細(xì)胞形態(tài) 。
（3）分子生物學(xué)研究：Western blot
步驟：蛋白抽提-蛋白定量-蛋白變性-制膠-上樣電泳-轉(zhuǎn)膜-染色-封閉-一抗孵育-洗膜-二抗孵育-洗膜-曝光-數(shù)據(jù)分析。
以β-actin作為內(nèi)參，檢測(cè)AMH、AMHR2、BAX、Bcl-2的蛋白表達(dá)量。
（4）組織學(xué)研究：濾泡計(jì)數(shù)
① HE切片制作：石蠟包塊包埋卵巢組織-切片-HE染色
② 濾泡計(jì)數(shù)：在光鏡下，從卵巢中心的最大橫截面開(kāi)始，在3個(gè)連續(xù)切片中對(duì)每個(gè)發(fā)育階段的卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù) ，計(jì)算平均值。切片厚度為5μm ，間隔為25μm 。為了避免重復(fù)計(jì)數(shù) ，只對(duì)含有卵母細(xì)胞核的卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù) 。根據(jù)Myers et al.（2004）對(duì)卵泡進(jìn)行分類。計(jì)算每只小鼠各切片中不同卵泡的平均數(shù)目。整個(gè)過(guò)程由2個(gè)技術(shù)人員各自計(jì)數(shù)2次。
【甲基苯丙胺是什么甲基苯丙胺命名】（5）卵巢功能研究：激素測(cè)量
顆粒細(xì)胞在37℃ ， 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，離心收集上清用ELISA檢測(cè)AMH、雌激素和孕酮的濃度。
（6）行為學(xué)研究：發(fā)情周期、交配能力、產(chǎn)仔數(shù)和后代體重的測(cè)定
MA處理結(jié)束2周后，通過(guò)陰道涂片灌洗檢查雌鼠是否改變了發(fā)情周期的規(guī)律和持續(xù)時(shí)間。當(dāng)發(fā)情周期短于4天或長(zhǎng)于5天被認(rèn)為是不規(guī)律的。
動(dòng)物每隔一天可以交配一次。兩只雌鼠和一只未經(jīng)處理的雄鼠被關(guān)在每個(gè)籠子里。第二天早上若在雌鼠身上觀察到到精子栓的存在，則證實(shí)了交配的成功。
幼崽出生時(shí)計(jì)算產(chǎn)仔數(shù)并稱量體重。
（7）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
使用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單向方差分析對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)、卵泡計(jì)數(shù)、激素水平、周期天數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)和幼崽的重量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用卡方檢驗(yàn)對(duì)不規(guī)則的小鼠雌激素周期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。p

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