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雙向電泳的步驟和原理 雙向電泳儀原理( 二 )


等速電泳是在樣品中加有領(lǐng)先離子(其遷移率比所有被分離離子的大)和終末離子(其遷移率比所有被分離離子的?。瑯悠芳釉陬I(lǐng)先離子和終末離子之間,在外電場(chǎng)作用下,各離子進(jìn)行移動(dòng),經(jīng)過一段時(shí)間電泳后,達(dá)到完全分離 。被分離的各離子的區(qū)帶按遷移率大小依序排列在領(lǐng)先離子與終末離子的區(qū)帶之間 。由于沒有加入適當(dāng)?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流,所得到的區(qū)帶是相互連接的(圖d),且因”自身校正”效應(yīng),界面是清晰的,這是與區(qū)帶電泳不同之處 。
電泳分離原理示意圖 a 移動(dòng)界面電泳b 區(qū)帶電泳 c 等電聚焦電泳 d 等速電泳L 領(lǐng)先離子T 終末離子 。
毛細(xì)管電泳: 1981年,Jorgenson和Luckas,用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析,柱效高達(dá)40萬/m,促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革,迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)——毛細(xì)管電泳 。
電泳原理
電泳裝置主要包括兩個(gè)部分:電源和電泳槽 。電源提供直流電,在電泳槽中產(chǎn)生電場(chǎng),驅(qū)動(dòng)帶電分子的遷移 。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類 。垂直板式電泳是較為常見的一種,常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離 。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板,玻璃板兩邊由塑料條隔開,在玻璃平板中間制備電泳凝膠,凝膠的大小通常是12cm,14 cm,厚度為1mm~2 mm,近年來新研制的電泳槽,膠面更小、更薄,以節(jié)省試劑和縮短電泳時(shí)間 。制膠時(shí)在凝膠溶液中放一個(gè)塑料梳子,在膠聚合后移去,形成上樣品的凹槽 。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液,或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中 。由于pH值的改變會(huì)引起帶電分子電荷的改變,進(jìn)而影響其電泳遷移的速度,所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的,緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定 。
E=V/L
為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的,下面簡(jiǎn)單介紹一下電泳的基本原理 。在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓(V),就會(huì)在電極中間產(chǎn)生電場(chǎng)強(qiáng)度(E),上式中L是電極間距離 。
在稀溶液中,電場(chǎng)對(duì)帶電分子的作用力(F),等于所帶凈電荷與電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積:F=q*E
上式中q是帶電分子的凈電荷,E是電場(chǎng)強(qiáng)度 。
這個(gè)作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動(dòng) 。在移動(dòng)過程中,分子會(huì)受到介質(zhì)粘滯力的阻礙 。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān),并與帶電分子的移動(dòng)速度成正比,對(duì)于球狀分子,F(xiàn)’的大小服從Stokes定律,即:
F’=6πrηυ,式中r是球狀分子的半徑,η是緩沖液粘度,υ是電泳速度(υ= d / t,單位時(shí)間粒子運(yùn)動(dòng)的距離,cm / s ) 。當(dāng)帶電分子勻速移動(dòng)時(shí): F = F’,∴ q·E = 6πrηυ
電泳遷移率(m)是指在單位電場(chǎng)強(qiáng)度(1V/cm)時(shí)帶電分子的遷移速度 。
所以:v/E=Q/6πrη
這就是遷移率公式,由上式可以看出,遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比,與分子的大小和緩沖液的粘度成反比 。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí),實(shí)際使用的是相對(duì)遷移率mR 。即:
上式中:d-帶電粒子泳動(dòng)的距離,t-電泳的時(shí)間,V-電壓,L-兩電極交界面之間的距離,即凝膠的有效長度 。因此,相對(duì)遷移率mR就是兩種帶電粒子在凝膠中泳動(dòng)遷移的距離之比 。
研究歷史
電泳(Electrophoresis)是指帶電荷的粒子或分子在電場(chǎng)中移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳 。大分子的蛋白質(zhì),多肽,病毒粒子,甚至細(xì)胞或小分子的氨基酸,核苷等在電場(chǎng)中都可作定向泳動(dòng) 。1937年Tiselius成功地研制了界面電泳儀進(jìn)行血清蛋白電泳,它是在一U型管的自由溶液中進(jìn)行的,電泳后用光學(xué)系統(tǒng)使各種蛋白所形成折光率差別成為曲線圖象,將血清蛋白分為白蛋白,α1-球蛋白,α2-球蛋白,β-球蛋白和γ-球蛋白五種,隨后,Wielamd 和Kanig 等于1948年采用濾紙條做載體,成功地進(jìn)行了紙上電泳 。從那時(shí)起,電泳技術(shù)逐漸被人們所接受并予以重視,繼而發(fā)展以濾紙,各種纖維素粉,淀粉凝膠,瓊脂和瓊脂糖凝膠,醋酸纖維素薄膜,聚丙烯酰胺凝膠等為載體,結(jié)合增染試劑如銀氨染色,考馬斯亮藍(lán)等大大提高和促進(jìn)生物樣品著色與分辨能力,此外電泳分離和免疫反應(yīng)相結(jié)合,使分辨率不斷朝著微量和超微量(1ng~0.001ng)水平發(fā)展,從而使電泳技術(shù)獲得迅速推廣和應(yīng)用 。在此主要介紹常用電泳的一般原理及其應(yīng)用 。


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